農業農村部公告第813號政策法規廣東省畜牧獸醫學會

學會簡介

　　廣東省畜牧獸醫學會是由廣東省民政廳批準成立的具有法人資格的全省性社會團體，是廣東省科學技術協會的組成部分，是黨和政府聯系畜牧獸醫科技工作者的橋梁和紐帶，是發展我省畜牧獸醫事業的重要社會力量?，F任理事長是廖明同志。

農業農村部公告第813號

時間：2024-08-22　　　來源：農業農村部　　　

為進一步加強水產養殖用獸藥研究指導工作，規范新獸藥研究活動，加快獸藥產品創新和上市應用，根據《獸藥管理條例》等有關規定，我部組織修訂了《水產養殖用抗菌藥物藥效試驗技術指導原則》等5個獸藥技術指導原則，制定了水生動物疫苗實驗室安全試驗和效力試驗等2個獸藥技術指導原則，現予發布，請參照執行。原農業部公告第2017號同時廢止。

特此公告。

附件：

1.水產養殖用抗菌藥物藥效試驗技術指導原則

2.水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗技術指導原則

3.水產養殖用驅（殺）蟲藥物藥效試驗技術指導原則

4.水產養殖用驅（殺）蟲藥物田間藥效試驗技術指導原則

5.水產養殖用消毒劑藥效試驗技術指導原則

6.水生動物疫苗實驗室安全試驗技術指導原則

7.水生動物疫苗實驗室效力試驗技術指導原則

農業農村部

2024年8月7日

附件 1

水產養殖用抗菌藥物藥效試驗技術指導原則

一、概述

水產養殖用抗菌藥物藥效試驗用于評價抗菌藥物防治水產動物目標適應證的效果和發現可能存在的不良反應，以確定藥物的有效性和給藥方案。

本指導原則適用于水產養殖用抗菌藥物的藥效試驗(II 期臨床試驗),僅代表目前對水產養殖用抗菌藥物藥效試驗研究的一般性認識，旨在為水產養殖用抗菌藥物藥效試驗研究者和注冊申請人制訂、實施與監督藥效臨床試驗等提供技術指導和參考。

二、試驗設計原則

試驗應遵循《獸藥臨床試驗質量管理規范》(獸藥 GCP)的規定。

試驗設計應遵循“隨機、對照、重復”的基本原則。隨機,即按機遇原則進行分組、取樣和試驗;對照，進行試驗研究必須設立對照組,通過對照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異，抵消或減少試驗誤差;重復,即實驗要有足夠的樣本含量,有重復的例數和平行操作,且試驗結果要有重現性。此外還應考慮均衡原則,均衡就是使對照組與試驗組中的非處理因素盡量達到均衡一致,使處理因素的試驗效應能更真實地反映出來。

不同的抗菌藥物作用機制不同,各有特點,本指導原則不可能涵蓋水產養殖用抗菌藥物藥效試驗研究的全部實際情況,開展藥效試驗研究時應結合受試藥物的自身特點、受試動物及其感染疾病的種類,遵循“具體問題具體分析”的原則,根據實際情況確定藥效試驗的內容和順序。

三、基本內容

( 一) 環境條件

每個試驗水體應能保持環境穩定,不受外界環境變化或污染的影響,且相對獨立。試驗水體必須能滿足水產動物的生理要求,單位試驗水體體積一般不小于 100L,放養密度應控制在不影響受試動物正常生理活動的范圍。試驗用水的水質應符合 GB11607《漁業水質標準》要求,自來水應曝氣 48h 以上,天然水應自然沉淀 24h 再過濾后使用。一般應在以下表格中規定的條件下進行試驗,特殊情況下按自然發病水溫進行試驗。

必要時可采取充氣、換水、控溫等措施以滿足受試動物必要的正常生長條件,試驗期間應按要求定期測定并記錄水溫、pH、溶解氧或鹽度(海水) 等參數,試驗用水的排放應符合獸藥 GCP 相關要求。

( 二 ) 受試動物

根據試驗的具體要求,合理選擇相應種類的健康水產動物,受試動物來源于規范的水產養殖生產單位。試驗前應在試驗環境暫養 1 ~2 周。試驗用水產動物數量應滿足統計學要求,一般規定每個試驗組設 3 個平行,每個平行的試驗動物最低數量:魚類幼體 30 尾,成體 15 尾;蝦、蟹、貝、參類幼體(變態后與成體相似的幼體)40 只,成體 20 只;龜、鱉、蛙類幼體(變態后與成體相似的幼體)20 只,成體 10 只。

( 三 ) 試驗藥物

1．受試藥物及來源。受試藥物應與擬上市的制劑完全一致,有相應的產品質量標準。受試藥物應采用一定規模生產的一個批次樣品,產品處方、制備工藝、設備應與最終生產條件一致,并在GMP 車間生產。受試藥物需有名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格)、貯藏條件等信息,并具有農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

2．對照藥物及來源。對照藥物應當已在我國批準上市,與受試藥物作用相似、適應證相同的藥物。對照藥物由申報單位提供,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。無符合要求的對照藥物時,選擇安慰劑作為對照藥物。

( 四 ) 疾病模型選擇

采用的疾病模型包括人工感染和自然感染兩種,可能的情況下,盡量采用人工感染。

1．人工感染。感染用的菌種應為具有代表性的標準致病菌種或專業機構鑒定保藏的菌種。如果采用自然感染病例分離的菌株,應詳細記錄其來源,并應經專業科研或檢測機構鑒定方可用于試驗。攻毒前需測定其包括受試藥物和對照藥物(但不限于受試藥物和對照藥物)在內的最低抑菌濃度(MIC),必要時測定最低殺菌濃度(MBC)。感染前需進行預試驗。感染途徑可采用注射、浸浴和涂抹病原菌等感染方式。感染量以能使 80% 以上感染動物死亡或出現明顯發病癥狀的劑量為最佳。試驗菌株經培養后配制成一定濃度的菌液,按照預實驗確定感染途徑和感染量進行感染。

也可采用與自然感染水產動物同居進行感染,但應對所用的自然感染水產動物的致病菌進行分離鑒定,以便確診病原。

人工感染的病例需通過發病過程和臨床癥狀診斷,證明水產動物已感染接種致病菌并發病后才能作為試驗病例。通過臨床癥狀不能診斷的,可通過對致病菌的分離鑒定進一步確診。

2．自然感染。應制訂自然感染病例入選條件。通過發病過程、臨床癥狀、病理剖檢、致病菌的分離鑒定,或血清學診斷,確診為試驗所需致病菌感染的發病動物才能作為試驗病例,各組試驗病例的發病嚴重程度應基本一致。

(五) 試驗分組

應采用隨機分組原則,試驗組數取決于抗菌藥物的類型、疾病的特征以及有效劑量的篩選等因素,臨床試驗一般應滿足如下要求:

1．不感染不給藥對照組;

2．感染不給藥對照組;

3．對照藥物組,應按照批準的給藥方案給藥;

4．受試藥物組,根據受試藥物的藥代動力學、體外抑菌試驗以及劑量篩選的試驗結果初步確定的給藥劑量,至少設高、中、低三個劑量組,中劑量一般為擬推薦劑量。

如受試藥物為復方制劑,應根據組方中各主要成分,分別增設單方藥物的推薦劑量對照組。

( 六 ) 給藥方案

臨床試驗采用受試藥物擬推薦的給藥途徑,注射給藥應標明注射部位。若受試藥物有多種給藥途徑,應該對每種給藥途徑分別進行試驗。根據受試藥物特性和藥代動力學、體外抑菌試驗結果制定合理的給藥劑量、頻次和療程。

一般要求在感染后個別動物出現癥狀即開始給藥;自然感染病例在病因確診后開始給藥。

(七) 觀察時間

結合受試抗菌藥物的藥效學和藥代動力學特性、受試水產動物、藥效試驗研究方案等確定觀察時間點和觀察時長。一般要求在停止給藥后還應繼續觀察 7 天以上。

( 八 ) 觀察指標

試驗期間每天觀察和記錄各組受試水產動物的發病時間、發病數、死亡時間、死亡數或存活數、癥狀出現或消失數等,同時注意采食量和行為的觀察。對于試驗期間死亡動物須進行病理檢查或病原菌分離,以確認受試動物是否因病原菌感染引起,如因其它原因死亡的,統計時應剔除。試驗結束后,對存活動物進行病理檢查。

四、效果評價

( 一) 評價指標

應根據詳細的試驗記錄,計算各組受試動物發病率或死亡率、

有效率和/ 或治愈率等。其計算公式如下:

發病率(% )= 發病動物數/ 受試動物數×100% ;

死亡率(% )= 死亡動物數/ 受試動物數×100% ;

有效率(% )= 癥狀好轉動物數/ 發病動物數×100% ;

治愈率(% )= 癥狀消失動物數/ 發病動物數×100% 。

必要時,也可以配合采用其它指標進行評價。

( 二 ) 效果評價

1．試驗的可靠性。在整個試驗中,對照藥物組必須有效,感染不給藥對照組死亡率≥80% 或發病率≥80% ,不感染不給藥對照組存活率≥90% ,否則試驗需重做。

2．試驗的有效性。以發病率或死亡率、有效率和/ 或治愈率進行判斷,并將受試藥物組間、受試藥物組與對照組(包括不感染不給藥對照組、對照藥物組或感染不給藥對照組)進行比較,對結果進行定性和定量的統計分析。常用的生物統計方法有 t 檢驗、x2檢驗、方差分析等,應根據實際情況進行選用。

3．結論。根據臨床癥狀、病理學變化觀察和統計學分析結果,確定受試藥物對本適應證的有效劑量及臨床推薦劑量;并提出臨床應用該藥物的注意事項、不良反應等。

五、試驗報告

為公正、科學地評價藥物的臨床療效,試驗報告應包括如下內容:

1．試驗目的;

2．試驗時間與地點;

3．試驗設計者、負責人、主要試驗人員及聯系方式;

4．試驗水質條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等;

5．受試藥物需注明藥物名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格),對照藥物還需注明用法用量;

6．試驗動物的品種、來源、體重或體長、年齡、健康狀況及檢疫情況等;

7．試驗分組、感染方案、給藥方案等;

8．試驗觀察現象與結果、數據處理與效果評價等;

9．結論;

10．參考文獻;

11．試驗單位(加蓋公章);

12．應歸檔保存原始資料,并注明保存地點、聯系人及聯系電話。

附件 2

水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗技術指導原則

一、概述

水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗用于進一步驗證水產養殖用抗菌藥物在實際生產條件下對靶動物目標適應證的有效性和安全性。

本指導原則適用于水產動物用抗菌藥物的田間藥效試驗,僅代表目前對水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗研究的一般性認識,旨在為水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗研究者和注冊申請人制訂、實施與監督臨床藥效試驗等提供技術指導和參考。

二、試驗設計原則

試驗應遵循《獸藥臨床試驗質量管理規范》 (獸藥 GCP) 的規定。

田間藥效試驗應在水產養殖用抗菌藥物藥效試驗結果的基礎上進行,參照水產養殖用抗菌藥物藥效試驗的試驗方案,并結合實際養殖條件、環境情況和病情等綜合考慮。

三、基本內容

水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗的建立主要包括試驗池、受試水產動物和數量的選擇,試驗藥物的說明,給藥方案以及觀察指標的確定等。

( 一 ) 試驗養殖單元要求

田間試驗須安排在歷年發病地區,飼養規范,實驗條件能得到有效控制的養殖場進行。試驗養殖單元可為水產養殖生產上所用的池塘、網箱及工廠化養殖車間等設施,每個試驗養殖單元應相對獨立,并配備必要的養殖工具和設施。同一區域內試驗池要求位置、面積、環境條件基本相似。養殖品種、放養密度、歷史條件和病史基本一致。

試驗期間應測定并記錄試驗池水的水溫、溶解氧、pH 值、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質指標。

( 二 ) 受試動物

1．數量。選用自然感染的水產動物或人工控制感染的水產動物,每個養殖單元水產動物數應不少于 300 尾(只),珍稀水產動物視情況而定。

2．品種。應與受試藥物擬推薦應用范圍相一致。不同靶動物品種和不同適應證應分別進行田間藥效試驗。應測定并記錄放養動物的種類、規格、比例、數量等指標。

3．抽檢動物數。每個平行組分別在給藥前和給藥療程結束后進行抽檢(必要時,需在觀察過程中抽檢一次),隨機抽取水產動物的最低檢查數量應不低于 15 尾(只)。

(三) 試驗藥物

1．受試藥物及來源。受試藥物應與擬上市的制劑完全一致,有相應的產品質量標準。受試藥物應采用一定規模生產的一個批次樣品,產品處方、制備工藝、設備應與最終生產條件一致,并在GMP 車間生產。

受試藥物需注明其名稱、主要輔料、生產廠家、生產批號、含量(或規格)、保存條件,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

2．對照藥物及來源。對照藥物應當已在我國批準上市,與受試藥物靶動物以目為分類基礎相似、作用相似、適應證相同。對照藥物由申報單位提供,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。無符合要求的對照藥物時,選擇安慰劑作為對照藥物。

(四) 病例的確診

選擇的自然感染病例應通過發病過程、臨床癥狀、病理剖檢、致病菌的分離鑒定或者快速診斷來確診,只有符合試驗所需致病菌感染的發病動物才能作為試驗病例,各組試驗病例的發病嚴重程度應基本一致。每個單元確診不少于 5 尾。

( 五 ) 試驗分組

田間藥效的試驗組數取決于抗菌藥物的類型和疾病的特征,也可根據實驗室藥效試驗的結果來確定。

試驗分組應設對照藥物組和受試藥物組,條件允許的情況下,設置不給藥對照組,受試藥物組設 2 ~ 3 個平行。對于有推薦劑量范圍的,至少設高、低二個劑量組。

(六) 給藥方案

根據水產養殖用抗菌藥物藥效試驗確定的用法和用量進行試驗。試驗期間不得使用其他藥物。

(七) 觀察時間

治療試驗在停止給藥后繼續觀察不得少于 7 天。

(八) 觀察指標

試驗期間每天觀察和記錄各組受試水產動物的攝食量、活動狀態、癥狀、死亡數和死亡時間等,并進行分析。同時觀察和記錄試驗期間動物可能出現的不良反應。必要時,對受試動物進行病理檢查和病原分離,以確認受試動物是否因目標病原菌感染發病,如因其它原因死亡的,統計時應剔除。

四、數據處理及效果評價

(一) 數據處理

應根據試驗記錄計算各組試驗動物的死亡率或治愈率。其計算公式如下:

死亡率(% )= 死亡動物數/ 受試動物數×100% ;

治愈率(% )= (用藥前抽檢發病率-用藥后抽檢發病率) / 用藥前抽檢發病率×100% ;

(二) 效果評價

1．試驗的可靠性。在整個試驗中,對照藥物組必須有效,否則試驗需重做。

2．試驗的有效性。試驗以死亡率或治愈率進行判斷,計算每個受試藥物組每個平行的死亡率,并與對照藥物組進行比較,對結果選擇合適的生物統計分析方法進行分析,考察受試藥物組與對照藥物組的差異性。

3．結論。根據攝食量、活動狀態、癥狀和死亡率等,確認受試藥物的推薦劑量;并提出或確認臨床應用該藥物的注意事項、不良反應等。

五、試驗報告

為公正、科學地評價藥物的臨床療效,試驗報告應包括如下內容:

1．試驗目的;

2．試驗時間與地點,天氣情況;

3．試驗設計者、負責人、主要試驗人員及聯系方式;

4．試驗池塘需注明換水率,水溫、溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽氮、硬度、鹽度、等水質條件;

5．受試藥物需注明藥物名稱、主要輔料、生產廠家、生產批號、含量(或規格),對照藥物還需注明用法用量;

6．試驗動物的品種、來源、體重或體長、年齡、健康狀況及檢疫情況等;

7．試驗分組、病例的確診、給藥方案等;

8．試驗觀察現象與結果、數據處理與效果評價等;用藥后水體其他生物的異常情況;

9．結論;

10．參考文獻;

11．試驗單位(加蓋公章);

12．應歸檔保存原始資料,并注明保存地點、聯系人及聯系電話。

附件 3

水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗技術指導原則

一、概述

水產養殖用驅(殺)蟲藥物的藥效試驗用于評價驅(殺)蟲藥物防治水產動物目標適應證的效果和發現可能存在的不良反應,以確定藥物的有效性和給藥方案。

本指導原則適用于水產養殖用驅(殺)蟲藥物的藥效試驗(II 期臨床試驗),僅代表目前對水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗研究的一般性認識,旨在為水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗研究者和注冊申請人制訂、實施與監督藥效臨床試驗等提供技術指導。

二、試驗設計原則

試驗應遵循《獸藥臨床試驗質量管理規范》(獸藥 GCP)的規定。

試驗設計應遵循“隨機、對照、重復”的基本原則。隨機,即按機遇原則進行分組、取樣和試驗;對照,進行試驗研究必須設立對照組,通過對照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異,抵消或減少試驗誤差;重復,即試驗結果要有重現性,要有重復例數和平行操作,且試驗結果要有重現性。此外還應考慮均衡原則,均衡就是使對照組與試驗組中的非處理因素盡量達到均衡一致,使處理因素的試驗效應能更真實地反映出來。

不同的驅(殺)蟲藥物作用機制不同,各有特點,本指導原則不可能涵蓋水產動物用驅(殺)蟲藥物藥效試驗研究的全部實際情況,當進行藥效試驗研究時應結合該藥物的自身特點、試驗水產動物及其感染疾病的種類,遵循“具體問題具體分析”的原則,根據實際情況確定藥效試驗的內容和順序。

三、基本內容

(一) 環境條件

每個試驗水體應能保持環境穩定、不受外界環境突然變化或污染影響,相對獨立。試驗水體必須能滿足水產動物的生理要求,單位試驗水體體積一般不小于 100L,放養密度應控制在不影響受試動物正常生理活動的范圍。

試驗用水的水質應符合 GB11607《漁業水質標準》要求,自來水應曝氣 48h 以上,天然水應自然沉淀 24h 再過濾后使用。一般應在以下表格中規定的條件下進行試驗,特殊情況下按自然發病水溫進行試驗。

必要時可采取充氣、換水、控溫等措施滿足以上規定的試驗條件,試驗期間應按要求定期測定并記錄水溫、pH、溶解氧或鹽度(海水)等參數,試驗用水的排放應符合獸藥 GCP 相關要求。

(二) 受試動物

根據試驗的具體要求,合理選擇相應種類的健康水產動物,受試動物來源于規范的水產養殖生產單位。試驗前應在試驗環境暫養 1 ~2 周。

試驗用水產動物數量應滿足統計學要求,一般規定每個試驗組設 3 個平行,每個平行的試驗動物最低數量:魚類幼體(變態后與成體相似的幼體)30 尾,成體 15 尾;蝦、蟹、貝類幼體(變態后與成體相似的幼體)40 只,成體 20 只;龜、鱉、蛙類幼體(變態后與成體相似的幼體)20 只,成體 10 只。

(三) 試驗藥物

受試藥物需有名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格)、貯藏條件等信息,并具有農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

(四) 疾病模型選擇

1．人工感染。感染用的蟲種可以為臨床分離或采集的蟲種,應詳細記錄其來源,且必須進行嚴格的病原鑒定。感染前需進行預試驗。感染方法和途徑可根據寄生蟲體種類決定。感染量應根據預實驗的結果,選擇原則上能使 90% 以上動物感染的劑量,選取感染程度(癥狀表現、蟲體密度等特征) 基本一致的個體進行試驗。以損傷或致死性的方式才能觀察寄生蟲感染情況的個體,感染率原則上應達到 70% 。

也可采用健康動物與自然感染個體進行同居感染,但應對所用的自然感染個體的致病蟲體進行分離鑒定,以便確定病原種類。

2．自然感染。采用自然感染的水產動物,應制訂自然感染病例入選條件。通過臨床癥狀、病理剖檢、致病蟲種的鑒定,確診為試驗所需致病蟲體感染的發病物才能作為試驗病例,各組試驗病例的發病嚴重程度應基本一致。

人工感染和自然感染病例的確診。水產動物體表及鰓絲感染的蟲體,試驗前應隨機抽取水產動物樣品不少于 10 尾(只),輕輕刮取體表粘液或剪取小塊鰓絲涂片鏡檢,感染率原則上應達到90% 以上。水產動物體內感染的蟲體,試驗前應隨機抽取水產動物樣品不少于 10 尾(只),進行剖殺后檢查組織或器官中蟲體數,感染率原則上應達到 70% 。

3．體外殺蟲試驗。特殊情況下,可進行離體(體外) 殺蟲試驗。如中華鳋或多態錨頭鳋,采集成蟲若干,在適宜條件下孵化后,收集幼蟲進行體外殺蟲試驗。

(五) 試驗分組

試驗組數取決于驅(殺)蟲藥物的類型、疾病的特征以及有效劑量的篩選等因素,試驗應滿足如下分組要求:

1．不感染不給藥對照組;

2．感染不給藥對照組;

3．對照藥物組,應按照批準的給藥方案給藥;

4．受試藥物組,根據受試藥物劑量篩選的試驗結果,確定給藥劑量,至少設高、中、低三個劑量組,中劑量一般為擬推薦劑量。如受試藥物為復方制劑,藥物對照組應根據組方中各主要成分,分別設單方藥物的推薦劑量對照組。

(六) 給藥方案

臨床試驗一般采用該藥擬推薦的給藥方案。受試藥物若有多種給藥方式,應該對每種給藥方式分別進行試驗。

(七) 觀察時間

根據寄生蟲的生活史,結合受試藥物的藥效學、受試動物、藥效試驗研究方案等確定觀察時間點和觀察時長。一般要求在停止給藥后繼續觀察,口服驅蟲藥物時間不得少于 10 天,浸浴殺蟲藥物時間不得少于 7 天。

(八) 觀察指標

給藥前進行寄生蟲學檢查,按不同種類的寄生蟲,分別檢查受試動物的體表、鰓、血液、腸道等器官或組織,分類鑒定并計數。

給藥后及時觀察受試動物健康狀況、行為特征和攝食情況,必要時進行生理生化指標檢查。記錄給藥前后每天動物的死亡數。驅殺體表寄生蟲試驗給藥后,應定期隨機抽樣檢查蟲體存活情況,并分類鑒定計數,同時記錄平均殘存蟲體數及殘存蟲體動物數。

驅殺體內寄生蟲試驗結束后,將全部試驗水產動物剖殺,檢查殘存的蟲體或蟲卵,分類鑒定并計數,同時記錄平均殘存蟲體數及殘存蟲體動物數。

四、數據處理與效果評價

(一) 數據處理

應根據詳細的試驗記錄,計算驅(殺)蟲率、驅凈率以及受試動物的日死亡率、總死亡率。公式如下:

驅(殺)蟲率(% )= (感染不給藥對照組平均殘留存活蟲體數-受試藥物組平均殘留存活蟲體數) / 感染不給藥對照組平均殘留存活蟲體數×100% ;

驅凈率(% )= 驅凈蟲體的動物數/ 全部試驗動物數×100% ;

日死亡率(% )= 每日死亡動物數/ 全部試驗動物數×100% ;

總死亡率(% ) = 試驗期間死亡動物總數/ 全部試驗動物數×100% 。

(二) 效果評價

1．試驗的可靠性。在整個試驗中,對照藥物組必須有效,感染不給藥組感染率原則上應達到 70% 以上,不感染不給藥組死亡率≤5% 。

2．試驗的有效性。將受試藥物組間、受試藥物組與對照藥物組進行比較,對驅(殺) 蟲率、驅凈率、死亡率等數據進行統計分析。評價指標根據疾病發生的具體情況選擇。常用的生物統計方法有 t 檢驗、x 2 檢驗和方差分析等,應根據實際情況進行選用。

3．結論。確認受試藥物對本適應證的治療效果及其推薦劑量;并提出臨床應用該藥物的注意事項、不良反應以及藥物的相互作用等。

五、試驗報告

為公正、科學地評價藥物的臨床療效,試驗報告應包括如下內容:

1．試驗目的;

2．試驗時間與地點;

3．試驗設計者、負責人、主要試驗人員及聯系方式;

4．試驗條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等;

5．受試藥物需注明藥物名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格),對照藥物還需注明用法用量;

6．試驗動物的品種、來源、體重或體長、年齡、健康狀況及檢疫情況等;

7．試驗分組、感染方案、給藥方案等;

8．試驗觀察現象與結果、數據處理與效果評價等;

9．結論;

10．參考文獻;

11．試驗單位(加蓋公章);

12．應歸檔保存原始資料,并注明保存地點、聯系人及聯系電話。

附件 4

水產養殖用驅(殺)蟲藥物田間藥效試驗技術指導原則

一、概述

水產養殖用驅(殺)蟲藥物的田間藥效試驗用于進一步驗證水產養殖用驅(殺)蟲藥物在實際生產條件下對靶動物目標適應證的有效性和安全性。

本指導原則適用于水產養殖用驅(殺)蟲藥物的田間藥效試驗,僅代表目前對水產養殖用驅(殺)蟲藥物田間藥效試驗研究的一般性認識,旨在為水產養殖用驅(殺)蟲藥物田間藥效試驗研究者和注冊申請人制訂、實施與監督藥效臨床試驗等提供技術指導和參考。

二、試驗設計原則

試驗應遵循《獸藥臨床試驗質量管理規范》 (獸藥 GCP) 的規定。

田間藥效試驗應在水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗結果的基礎上進行,參照水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗的試驗方案,并結合實際養殖條件、環境情況和病情等綜合考慮。

三、基本內容

(一) 試驗養殖單元要求

試驗期間應測定并記錄試驗池水的水溫、溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質指標。

(二) 受試動物

1．受試動物要求。選用自然感染的水產動物或人工控制感染的水產動物,每個養殖單元水產動物數應不少于 300 尾(只),珍稀水產動物視情況而定。

(三) 試驗藥物

受試藥物需注明其名稱、生產廠家、生產批號、含量( 或規格)、保存條件,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

2．對照藥物及來源。對照藥物應當已在我國批準上市,與受試藥物作用相似、適應證相同。對照藥物由申報單位提供,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。無符合要求的對照藥物時,選擇安慰劑作為對照藥物。

(四) 病例的確診

水產動物體表及鰓絲感染的蟲體,輕輕刮取體表粘液或剪取小塊鰓絲等病灶涂片鏡檢,確定給藥前的感染率和感染強度。水產動物體內感染的蟲體,進行剖殺后檢查組織或器官中目標蟲體數,確定給藥前的感染率和感染強度。

(五) 試驗分組

田間藥效的試驗組數取決于驅(殺)蟲藥物的類型和疾病的特征,也可根據實驗室藥效試驗的結果來確定。試驗分組應設對照藥物組和受試藥物組,條件允許的情況下,設置不給藥對照組,受試藥物組設 2 ~ 3 個平行。對于有推薦劑量范圍的,至少設高、低二個劑量組。

(六) 給藥方案

根據水產養殖用驅(殺)蟲藥物藥效試驗確定的用法和用量進行試驗,受試藥物若有多種給藥方式,應該對每種給藥方式分別進行試驗。試驗期間不得使用其他藥物。

(七) 觀察時間

(八) 觀察指標

給藥前進行寄生蟲學檢查,按不同種類的寄生蟲,分別檢查受試動物的體表、鰓、血液、腸道等器官或組織,分類鑒定并計數。給藥后及時觀察受試動物健康狀況、行為、攝食以及死亡情況,并對死亡病例進行剖檢。必要時進行生理生化指標檢查。

驅殺體表寄生蟲試驗給藥后,應定期隨機抽樣檢查蟲體存活情況,并分類鑒定計數,同時記錄平均殘存蟲體數及殘存蟲體動物數。

驅殺體內寄生蟲試驗結束后,將隨機抽取一定數量的試驗水產動物進行剖殺,檢查殘存的蟲體或蟲卵,鑒定并分類計數,同時記錄平均殘存蟲體數及殘存蟲體動物數。

四、數據處理與效果評價

(一) 數據處理

應根據詳細的試驗記錄,計算驅(殺)蟲率、驅凈率以及受試動物的日死亡率。公式如下:

驅(殺)蟲率(% )= (用藥前平均殘留存活蟲體數-用藥后平均殘留存活蟲體數) / 用藥前平均殘留存活蟲體數×100% ;

驅凈率(% )= (用藥前抽檢帶蟲率-用藥后抽檢帶蟲率) / 用藥前抽檢帶蟲率×100% ;

日死亡率(% )= 每日死亡動物數/ 全部試驗動物數×100% ;

總死亡率(% ) = 試驗期間死亡動物總數/ 全部試驗動物數×100% 。

(二) 效果評價

1．試驗的可靠性。在整個試驗中,對照藥物組必須有效,否則試驗需重做。

2．試驗的有效性。將受試藥物組間、受試藥物組與對照藥物組進行比較,對驅(殺) 蟲率、驅凈率、死亡率等數據進行統計分析。常用的生物統計方法有 t 檢驗、x 2 檢驗和方差分析等,應根據實際情況進行選用。

3．結論。確認受試藥物對本適應證的治療效果及其推薦劑量;并提出或確認臨床應用該藥物的注意事項、不良反應等。

五、試驗報告

為公正、科學地評價藥物的臨床療效,試驗報告應包括如下內容:

1．試驗目的;

2．試驗時間與地點,天氣情況;

3．試驗設計者、負責人、主要試驗人員及聯系方式;

4．試驗水質條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等;

5．受試藥物需注明藥物名稱、主要輔料、生產廠家、生產批號、含量(或規格)、推薦使用的方法用量,對照藥物還需注明用法用量;

6．試驗動物的品種、來源、體重或體長、年齡、健康狀況及檢疫情況等;

7．試驗分組、病例的確診、給藥方案等;

8．試驗觀察現象與結果、數據處理與效果評價等;用藥后水體其他生物的異常情況;

9．結論;

10．參考文獻;

11．試驗單位(加蓋公章);

12．應歸檔保存原始資料,并注明保存地點、聯系人及聯系電話。

附件 5

水產養殖用消毒劑藥效試驗技術指導原則

一、概述

水產養殖用消毒劑的藥效試驗用于評價水產養殖用消毒劑對水產動物機體外環境、工具及設施的消毒效果和(或)水產動物目標適應證的防治效果的相關試驗,以確定消毒劑的有效性和合理使用方案,并發現可能存在的不良反應。

本指導原則適用于水產養殖用消毒劑的藥效試驗(包括消毒效果試驗和目標適應證的防治效果試驗),僅代表目前對水產養殖用消毒劑藥效試驗研究的一般性認識,旨在為水產養殖用消毒劑藥效試驗研究者和注冊申請人制訂、實施與監督藥效臨床試驗等提供技術指導和參考。

新研制、仿制及其復合型水產養殖用消毒劑需根據本指導原則要求完成全部消毒試驗項目;已批準在衛生或陸生動物上使用的消毒劑移植水產動物使用時,需完成實驗室定性、定量消毒效果試驗和現場消毒試驗;國外注冊水產養殖用消毒劑需復核定量及現場消毒試驗;以潑灑或藥浴方式用于養殖水體,并具有治療水產動物疾病功效的消毒劑除完成相關要求的消毒效果試驗外,還需進行田間藥效試驗。

二、試驗設計原則

試驗應遵循《獸藥臨床試驗質量管理規范》 (獸藥 GCP) 的規定。

試驗設計應遵循“隨機、對照、重復”的基本原則。隨機,即按機遇原則進行分組、取樣和試驗;對照,進行試驗研究必須設立對照組,通過對照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異,抵消或減少試驗誤差;重復,即試驗要有足夠的樣本含量,有重復的例數和平行操作,且試驗結果要有重現性。此外還應考慮均衡原則,均衡就是使對照組與試驗組中的非處理因素盡量達到均衡一致,使處理因素的試驗效應能更真實地反映出來。

三、基本內容

(一) 試驗材料

1．菌毒種。試驗用菌(毒)種應為具有代表性的標準致病菌(毒)種或專業機構鑒定保藏的菌(毒)種。如果采用自然感染病例分離的菌株,應詳細記錄其來源,并應經專業科研或檢測機構鑒定方可用于試驗。在選擇消毒試驗用的致病病毒株時,注意所用病毒株應代表一個很明確的病毒組,抵抗力強,容易管理并可高滴度生長,且易于純化。

水產動物臨床常見的、有代表性的菌(毒)種如下所示,根據消毒劑特定用途或試驗特殊需要,可增選其它菌(毒)株。

(1) 細菌繁殖體。氣單胞菌(Aeromonas);愛德華氏菌( Ed-wardsiella);弧菌(Vibrio);鏈球菌(Streptococcus);黃桿菌(Flavobac-terium)。

(2)細菌芽孢?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)。

(3)真菌(根據用途選做)。水霉(Saprolegnia)。

(4)病毒(根據用途選取合適的病毒)。

2．培養基。普通肉湯培養基、營養瓊脂培養基、馬丁肉湯培養基、馬丁瓊脂培養基、沙堡液體培養基、沙堡瓊脂培養基及其與試驗菌種相對應有特別要求的培養基。培養基的選用和配制方法見獸藥典。

3．試驗消毒劑

(1)受試消毒劑及來源。受試消毒劑應與擬上市的制劑完全一致,有相應的產品質量標準。受試藥物應采用一定規模生產的一個批次樣品,產品處方、制備工藝、設備應與最終生產條件一致,并在 GMP 車間生產。受試消毒劑需注明其名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格)、保存條件,并提供農業農村部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

(2)對照消毒劑及來源。

對照消毒劑應當已在我國批準上市,與受試消毒劑作用相似、適應證或用途相同。由申報單位提供,并提供農業農業部認定的檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。

4．中和劑。選擇的中和劑應對試驗菌種無抑制作用,在最大試驗濃度的消毒劑中加入中和劑后對試驗菌種的抑制作用應完全消除,此時中和劑的濃度可以作為本試驗添加濃度。常用消毒劑的中和劑參見下表。

(二) 試驗方法

試驗菌(毒)種選用水產動物臨床常見的、有代表性的菌(毒)種或目的(目標)菌(毒)種。

1．實驗室消毒能力測定試驗一般分四組,即受試消毒劑組、對照消毒劑組、空白對照(不感染不處理)組和陰性對照(感染不處理)組。每組試驗應做 3個平行。

(1)定性測定。細菌、真菌孢子測定方法:先將制備好的菌液表：常用消毒劑的中和劑消毒劑（濃度）中和劑（濃度）含氯（溴、碘）消毒劑（有效氯、溴或碘 0.1～0.5%）硫代硫酸鈉（0.1%～1.0%）過氧乙酸（0.1～0.5%）硫代硫酸鈉（0.1%～0.5%）過氧化氫（1.0～3.0%）硫代硫酸鈉（0.5%～1.0%）戊二醛（2%）甘氨酸（1%）季銨鹽類消毒劑（0.1～0.5%）吐溫 80（0.5～3.0%）洗必泰（0.1～0.5%）卵磷酯（1.0～2.0%）含表面活性劑的各種復方消毒劑吐溫 80（3.0%）酚類消毒劑（3.0～5.0%）吐溫 80（3.0～5.0%）堿類消毒劑等當量酸酸類消毒劑等當量堿采用比濁法進行活菌計數,然后用 0． 03M 的 pH 為 7． 2 的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌 5×10 5 ~5×10 6 CFU/ ml 的試驗菌液,取 9 支試管,每管加無菌蒸餾水 2． 5ml,于第 1 管加一定濃度的受試消毒劑溶液2． 5ml,混勻后,由第 1 管取 2． 5ml 至第 2 管,按二倍稀釋法依此類推,直至第 9 管,混合后取出 2． 5ml 棄去,向每管加 2． 5ml 試驗菌液后置 20℃水浴中 5、10、30、60min 或其它特定的作用時間。以對照消毒劑溶液代替受試消毒劑溶液,同時進行上述各步驟,作為對照消毒劑組;另取 2 支試管,進行平行試驗,其中一管只加菌液不加消毒劑的作為陰性對照,另一管不做任何處理的作為空白對照。每管各取 0． 5ml 加入含足量中和劑的 4． 5ml 液體培養基中,混勻,中和 10min,再取出 0． 5ml 加入 4． 5ml 液體培養基內。將接種菌株的培養基管置適宜溫度下培養,若發生混濁即表示有細菌生長。若肉湯不變混濁,應繼續培養至第 7d,若仍不混濁方可判為無菌生長。

結果判定:以無菌生長管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度,以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。真菌菌絲測定方法在試驗菌塊制備、接種、中和劑添加體積和結果觀測等方面應根據實際情況進行調整。

(2)定量測定。細菌、真菌孢子測定方法:先將制備好的菌液采用比濁法進行活菌計數,然后用 0． 03M 的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌 10 6 ~10 7 CFU/ ml 的試驗菌液;吸取 0．5ml 試驗菌液分別于測試濃度的受試消毒劑和對照消毒劑溶液4． 5ml 內,置 20℃ 水浴5min 或其它特定的作用時間,立即分別吸取上述菌藥混合液1． 0ml,加入 9． 0ml 與受試消毒劑和對照消毒劑相對應的中和液中混勻。以 0． 03M 的磷酸鹽緩沖液代替消毒劑溶液,同時進行上述各步驟,作為陰性對照組;以不做任何處理的作為空白對照。中和10min 后采用平板菌落計數法進行活計數,計算殺菌率及殺滅指數。

活菌培養計數時,細菌繁殖體在適宜的溫度下培養 18 ~ 24h,觀察最終結果;細菌芽孢培養溫度為 37℃,培養時間一般為 72h 后觀察最終結果;真菌孢子在適宜的溫度下培養 24h ~ 72h 后觀察最終結果。

結果判斷:

消毒 t 時的殺菌率(Pt)= ((n0-nt) / n0)×100%

殺滅指數(KI)= n0/ nt

以上兩式中:n0 為對照組活菌數,nt 為實驗組活菌數。

病毒測定方法:分別取不同濃度的消毒劑 4． 5ml 與適當濃度的特定病毒溶液 0． 5ml 混合,置 20℃ 水浴 5min 或其它特定的作用時間,同時設生理鹽水或培養基為對照組。分別取上述各組溶液各 1ml,加入中和劑 9ml,混勻,作用 10min,倍比稀釋,每個稀釋度接種到敏感細胞上,測定其病毒滴度。

結果判斷:

病毒滅活率% =(消毒前病毒滴度-消毒后病毒滴度) / 消毒前病毒滴度×100%

2．養殖水體現場消毒試驗。在完成實驗室定性、定量消毒能力測定的基礎上,進行特定病原菌和自然菌養殖水體現場消毒試驗。根據消毒劑的殺菌性能及對水體理化指標、靶動物的影響程度,通過本試驗確定實際使用方法、濃度及作用時間等。

(1)目標病原菌養殖水體現場消毒試驗。

試驗用水:應符合 GB11607《漁業水質標準》要求,在 15d 以內未使用過任何消毒劑的池塘中取 200L 養殖水,分別裝入 6 個水簇箱中,每箱 20L,試驗前后測定并記錄水體的 pH、溶解氧、水溫、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等指標。將特定病原菌制成菌液加入養殖水體中,使水體中菌液濃度為 10 5 ~10 6 CFU/ mL。

試驗分組:受試消毒劑組一般設高、中(推薦使用濃度)、低三個濃度受試消毒劑試驗組。

對照消毒劑組按推薦使用濃度消毒。

陰性對照組染菌不施消毒劑組。

空白對照組不染菌不施消毒劑組。

測定方法:消毒前和消毒后 10、30、60min 或其它特定的作用時間采混勻后的各組水樣 1ml,迅速加入 9ml 中和液中混勻,采用平板菌落計數法分別進行活菌計數,計算殺菌率。

結果判斷:殺菌率 = (消毒前活菌數-消毒后活菌數) / 消毒前活菌數×100%

(2)養殖水體現場消毒試驗。試驗宜安排在歷年發病地區,飼養規范,實驗條件能得到有效控制的養殖場的三口池塘中進行。每個試驗池應相對獨立,位置、水深、面積、環境條件基本相似。試驗水體應符合 GB11607《漁業水質標準》要求,在 15d 以內未使用過任何消毒劑的養殖池塘水。試驗期間應測定并記錄試驗水體的水溫、pH、溶解氧、透明度、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質指標,同時觀察試驗池中魚的攝食量、活動狀態等。該試驗只設受試消毒劑組,不設空白對照組和對照消毒劑組(由于每口池塘中的微生物種群、數量以及水體理化指標有差異),根據受試消毒劑擬推薦的用法和用量進行試驗,試驗應做 3個平行。消毒前和消毒后 30、60、120min 或其它特定的作用時間,沿試驗池塘對角線選取 3 個點(對角線兩端離池塘邊角 3m 各 1 個點,正中心 1 個點),用規格 1L 采水器分別于 3 個點的水面下 10 ~15cm 處(或其它特定要求的取樣點)取水樣,然后混合,吸取混勻后的水樣 1ml 迅速加入 9ml 中和液中混勻,置 4℃處冷藏保存不得超過 6 小時。采用平板菌落計數法分別進行活菌計數,計算殺菌率。

3．影響消毒劑消毒效果因素試驗。用于養殖水體的消毒劑,其藥效往往受目標菌的種類、消毒劑濃度、消毒作用時間、消毒時的水溫、pH 值及有機物濃度等因素的影響。應采用單因素試驗法(即除被試因素外,其他有關因素都固定在常用水平上)進行定量消毒試驗,測定不同影響因素、不同水平上的殺菌率,并互相比較。

4．田間藥效試驗。水產養殖用消毒劑以潑灑或藥浴方式用于養殖水體后,可通過體表和鰓等組織器官進入水產動物體內,對體內病原菌起到抗菌作用,具有治療水產動物疾病的功效,其藥效試驗設計方案參見《水產養殖用抗菌藥物田間藥效試驗技術指導原則》。

(三) 效果評價

1．試驗的可靠性。在整個試驗中,對照消毒劑組必須有效;在實驗室消毒能力測定試驗中,陰性對照組必須有菌生長,空白對照不能有菌生長,否則試驗需重做。

2．測試消毒效能,其殺菌率或病毒滅活率應達 99． 9% 以上。測試殺菌(滅毒)效能,其殺菌率或病毒滅活率須達 100% 。當低于此指標時,則應提高消毒劑的濃度或延長作用時間,重新試驗。

3．消毒效果。以殺菌率或病毒滅活率進行判斷,并將受試消毒劑組間、受試消毒劑組與對照組(包括對照消毒劑組或感染不施消毒劑組)進行比較,對結果進行定性和定量的統計分析。常用的生物統計方法有 t 檢驗、x 2 檢驗、方差分析等,應根據實際情況進行選用。

4．結論。根據消毒效果統計結果,同時結合消毒劑對水體理化因子、靶動物的影響情況以及影響消毒劑消毒效果因素試驗結果,確認受試消毒劑的推薦劑量;并提出或確認臨床應用該消毒劑的注意事項、不良反應等。

四、試驗報告

為公正、科學地評價消毒劑的臨床療效,試驗報告應包括如下內容:

1．試驗目的;

2．試驗時間與地點;

3．試驗設計者、負責人、主要試驗人員及聯系方式;

4．試驗水質條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等;

5．受試消毒劑需注明消毒劑名稱、生產廠家、生產批號、含量(或規格),對照消毒劑還需注明用法用量;

6．消毒能力定性與定量測定方法、養殖水體目標菌與自然菌的消毒試驗方法;

7．影響消毒劑藥效因素試驗方案(必要時);

8．消毒劑田間藥效試驗方案(必要時);

9．試驗觀察現象與結果、數據處理與效果評價等;

10．結論;

11．參考文獻;

12．試驗單位(加蓋公章);

13．應歸檔保存原始資料,并注明保存地點、聯系人及聯系電話。

五、名詞解釋

1．消毒,是指用物理的、化學的或生物學的方法殺滅或清除外環境中的各種病原微生物,使之達到不至于引起疾病的數量。所謂“外環境”除包括無生命的固體物表面、液體和氣體外,也包括有生命的動物機體的體表和淺表體腔。

2．消毒劑,是主要用于殺滅外環境中病原微生物的化學藥物。

3．抗菌,是指抑制動物體內微生物的生長繁殖,或將其殺滅。主要指動物全身用藥。

附件 6

水生動物疫苗實驗室安全試驗技術指導原則

一、目的

為水生動物疫苗實驗室安全試驗研究提供原則性指導。

二、背景

水生動物疫苗的安全性是考察其質量的最重要指標之一。農業部公告第 442 號對獸用疫苗制品的實驗室安全試驗項目進行了詳細規定。

三、基本要求

(一) 生物安全要求

實驗室及動物實驗室的生物安全條件應符合國家有關實驗室生物安全標準。

(二) 試驗用動物的要求

1．實驗室安全試驗應使用靶動物進行。有充分資料證明與靶動物安全試驗結果有相關性時,可使用其他敏感的水生動物作為模式動物。

2．實驗室安全試驗中所用實驗動物應健康易感,不攜帶影響試驗結果判定的特定病原或特定抗體。必要時應使用普通級或SPF 級易感實驗動物。

3．試驗用動物的種類、年齡、個體大小、體重和生理狀態(如性成熟)應與疫苗說明書中擬規定的靶動物相一致。試驗用動物的來源/ 遺傳背景應盡量避免存在差異性。

4．試驗中應使用敏感性高的品系。

5．每批疫苗制品的實驗室安全試驗中所用水生動物應不少于 30 尾,來源困難或經濟價值高的動物應不少于 5 尾。

(三) 養殖水質的要求

在疫苗接種期間,實驗養殖用水的水質參數,如溫度和鹽度(如淡水與海水)應與疫苗應用的實際養殖環境相似。必要時應設置合理的溫度梯度。

(四) 疫苗制品的要求

實驗室安全試驗中所用實驗室制品的生產用菌(毒、蟲)種、制品組成和配方等,應與規?；a的產品相同。實驗室制品應經過必要的性狀、含量、純粹/ 純凈性等初步檢驗,且結果須在預期的可接受范圍內。實驗室制品中主要成分的含量應不低于規?；?/span>生產時的出廠標準。

(五) 試驗設計

1．在試驗開始前,應制定詳細的實驗室安全試驗方案,其內容應包括受試疫苗的種類,試驗開始和結束的日期,實驗動物的年齡、種類等特征,疫苗配方,對照組的設置,每組動物的來源和數量、飼養條件、試驗管理和觀察方式,結果的判定方法及標準等。

2．試驗時應設置空白對照組。如有對照疫苗,還可設對照疫苗組。

四、實驗室安全試驗的內容和方法

可采用肉眼觀察和/ 或顯微鏡觀察方法,至少觀察 14 日。每日監測試驗用動物的死亡、發病、全身和/ 或局部反應情況。應監測和記錄所有不良反應的性質和頻率。

(一)一次單劑量接種的安全試驗

按照推薦的接種途徑,用適宜規格(日齡、體重或體長)的靶動物,接種 1 個劑量,至少觀察 2 周。評估指標應包括臨床癥狀、局部炎癥、組織病變等。對于可用于多種動物的疫苗制品,應用各種靶動物進行安全試驗。

(二)多次接種的疫苗制品應進行單劑量重復接種安全試驗

有關要求同一次單劑量接種的安全試驗。

(三) 一次超劑量接種的安全試驗

按照一次單劑量接種的安全試驗進行,但接種劑量為推薦免疫劑量的數倍至一百倍不等。通常情況下,滅活疫苗的安全試驗劑量為推薦免疫劑量的 2 倍,活疫苗的安全試驗劑量為推薦免疫劑量的 10 ~100 倍。根據不同使用途徑選擇合適的劑量。

(四) 對共患病原微生物或已有文獻報道有共感染的非靶動物、非使用日齡靶動物的安全試驗(活疫苗可能適用)

有些病原可感染多種動物或多個日齡段的動物,這類制品的安全試驗中,除應考察疫苗制品對靶動物和使用日齡靶動物動物的安全性外,還應對非使用對象動物和非使用日齡動物進行實驗室安全試驗,以考察對靶動物群使用該疫苗制品后對非靶動物群可能引起的安全風險。

(五) 疫苗水平傳播試驗(活疫苗可能適用)

評估使用該類疫苗免疫后,對周圍飼養的同品種易感動物的潛在危害性及其對環境的污染,為正確使用疫苗提供科學依據。

(六) 對靶動物生產性能的影響試驗

對食用水生動物的疫苗制品應進行本項試驗。使用這類疫苗制品后,觀察記錄一定周期內靶動物的生長情況,如體重變化、飼料系數等,評估疫苗制品對動物生產性能的影響。如果在一定試驗周期內無法評價對生產性能的影響,可用臨床試驗數據代替。

(七) 其他安全試驗

用于制備水生動物疫苗的一些非生物源性物質,如礦物油佐劑、鋁膠佐劑等,用于食品動物后,可能對人類的生命健康造成危害,這類制品的安全試驗中應包括有關化學物質在靶動物體內的殘留試驗,為制定該制品的休藥期提供必要的支持性數據。

(八) 相關說明

上述實驗室安全試驗項目中,第(一)和(三)項試驗通常是必不可少的,第(二)、(四)、(五)、(六)、(七)項試驗有時不是必須的,應根據疫苗制品的種類、性質、靶動物等具體情況選擇進行。第(三)項內容通常是制定成品安全檢驗標準的最直接依據,應有連續 3 批實驗室疫苗制品的試驗數據。

附件 7

水生動物疫苗實驗室效力試驗技術指導原則

一、目的

為水生動物疫苗實驗室效力試驗研究提供原則性指導。

二、背景

水生動物疫苗的免疫效力是考察其質量的最重要指標之一。農業部公告第 442 號對獸用疫苗的實驗室效力試驗項目進行了詳細規定。

三、基本要求

(一) 生物安全要求

實驗室及動物實驗室的生物安全條件應符合國家有關實驗室生物安全標準。

(二) 實驗用動物的要求

1．實驗室效力試驗應使用靶動物進行。有充分資料證明與靶動物效力試驗結果有平行關系的,可使用其他動物作為替代動物。

2．實驗室效力試驗中所用試驗用動物應健康易感,不攜帶影響試驗結果判定的特定病原或特定抗體。必要時應使用普通級或SPF 級易感實驗動物。

4．每批疫苗制品的實驗室效力試驗中所用水生動物應不少于 30 尾,來源困難或經濟價值高的動物應不少于 5 尾。

(三) 養殖水質的要求

在疫苗接種期間,實驗養殖用水的水質參數,如溫度和鹽度(如淡水與海水)應與疫苗應用的實際養殖環境相似。必要時應設置合理的溫度梯度。

(四) 對制品的要求

實驗室效力試驗中所用實驗室疫苗制品的生產用菌(毒、蟲)種、制品組成和配方等,應與規?；a的產品相同。實驗室疫苗制品應經過必要的性狀、含量、純粹/ 純凈性等初步檢驗,且結果須在預期的可接受范圍內。

為了同時證明產品“規程”中所規定的基礎種子使用代次范圍的合理性,通常用處于最高代次水平的病毒(或細菌)抗原制備疫苗后,進行效力試驗。一旦試驗結果證明最高代次水平的疫苗具有令人滿意的免疫效果,則可認為規定范圍內的基礎種子均具有令人滿意的免疫原性。

如果每批規?；a的產品出廠時的“效力檢驗”采取與參考疫苗對比的方法,則在實驗室效力試驗中,除應使用實驗室制品進行效力試驗外,還應用參考疫苗進行系統的效力試驗。

(五) 對攻擊用強毒的要求

1．在多數實驗室效力試驗中可能會使用攻毒用強毒。對已經有國家標準強毒株的,應使用標準強毒株,必要時增加使用當時的流行株。對沒有國家標準強毒株的,可使用自行分離的強毒株,但需報告其來源、歷史和有關鑒定結果。

2．使用高致病性病原微生物的,應按有關規定事先獲得有關部門批準。

(六)試驗設計

1．在試驗開始前,應制定詳細的實驗室效力試驗方案,其內容應包括受試疫苗的種類,試驗開始和結束的日期,試驗用動物的年齡、種類等特征,疫苗配方,對照組的設置,每組動物的來源和數量、飼養條件、試驗管理和觀察方式,結果的判定方法及標準等。

2．試驗時應設置空白對照組。如有對照疫苗,還可設對照疫苗組。

四、實驗室效力試驗的內容及方法

(一) 靶動物免疫攻毒試驗

該方法是考察水生動物疫苗免疫效力的常規方法。其基本方法是:用實驗室疫苗制品接種一定數量的動物,經一定時間后,采用攻毒用強毒株同時對上述免疫動物和對照動物進行攻毒,在攻毒后一定時間內,觀察動物的發病或死亡情況,統計免疫及對照動物發病率或死亡率,或計算相對保護率,評估制品的效力;必要時,在觀察期結束時,將所有動物撲殺,進行病理組織學檢查,有時還應進行病原分離,根據免疫動物和對照動物的眼觀病理學變化、組織病理學變化或病原分離情況評估制品的免疫效力。靶動物免疫攻毒試驗的具體方法可分為定量免疫定量強毒攻擊法、變量免疫

定量強毒攻擊法、定量免疫變量強毒攻擊法等,具體試驗中可根據疫苗制品和疾病的具體情況選擇一種或數種適宜方法。

1．定量免疫定量強毒攻擊法。該方法中以定量的受試疫苗接種適宜動物,經一定時間后,用定量的強毒進行攻擊,觀察動物接種后所建立的免疫力。

2．定量免疫變量強毒攻擊法。該方法中將動物分為兩大組,一為免疫組,一為對照組,兩大組又各分為相等的若干小組,每小組的動物數相等。免疫組各小組動物均用同一劑量的受試疫苗進行免疫接種,經一定時間后,與對照組一起,同時用不同稀釋度強毒進行攻擊,觀察、統計免疫組與對照組各小組的發病率、死亡率、病變率或感染率,分別計算免疫組與對照組的 LD50(或 ID50),比較免疫組與對照組動物對不同劑量強毒攻擊的耐受力。

3．變量免疫定量強毒攻擊法(PD50 試驗)。該方法中疫苗稀釋為不同的免疫劑量,并分別接種動物,間隔一定時間待動物的免疫力建立以后,各免疫組均用同一劑量的強毒攻擊,觀察一定時間,用統計學方法計算能使 50% 的動物得到保護的免疫劑量(PD50)。

4．有關說明。如因動物來源困難等導致無法用靶動物建立適宜的攻毒模型,并有充分的科學依據證明采用替代動物抗體測定法、替代動物免疫攻毒法等其他方法與靶動物免疫攻毒效力之間有一定相關性時,可采用替代方法取代靶動物免疫攻毒試驗。

(二) 疫苗抗原( (細細毒菌或病毒) ) 含量與靶動物免疫攻毒保護力究相關性的研究( (最最驗小免疫劑量試驗) )疫苗內抗原(細菌或病毒)含量與免疫攻毒保護率之間,在一定范圍內通常存在明顯平行關系,可根據最小免疫劑量試驗結果建立疫苗成品的抗原(細菌或病毒)含量標準,對符合抗原(細菌或病毒)含量標準的疫苗,就無需對每批疫苗進行免疫攻毒效力檢驗。最小免疫劑量的試驗方法如下:用不同劑量的疫苗分別接種動物,經一定時間后進行攻毒或采用已經證明與免疫攻毒方法具有平行關系的替代方法進行免疫效力試驗,統計出使動物獲得較好保護力(通常應達到 80% ~ 100% )的最低的疫苗接種量,就是最小免疫劑量。如果疫苗使用對象包括多種動物或多種日齡動物,則應針對各種或各日齡段靶動物測定最小免疫劑量。

(三) 免疫產生期及免疫持續期試驗

1．用實驗室疫苗制品接種一定數量的動物。接種后,每隔一定時間,用攻毒用強毒對一定數量的免疫動物和未接種的對照動物同時進行攻毒或采用已經確認與攻毒保護率具有平行關系的血清學方法測定抗體水平,觀察其產生免疫力的時間、免疫力達到高峰期的時間及高峰期持續時間。以接種后最早出現良好免疫力的時間為該疫苗制品的免疫產生期,以接種后保持良好免疫力的最長時間為免疫持續期。

2．如果是季節性疾病,只要能夠證明疫苗的免疫力能持續到接種后的一年中疾病的自然發生期末。不論是否進行加強免疫接種,均應提出在此后一年(或幾年)的發病季節中的免疫力情況。

3．免疫期試驗應在嚴格控制的實驗室條件下進行。若因免疫期過長、人工飼養對實驗用動物影響過大等原因導致已有實驗室條件不足以滿足整個免疫期內的試驗,則可在臨床試驗中進行免疫期驗證。在進行臨床免疫期試驗的過程中,應確保疫苗接種的靶動物不發生并發性感染,有必要設同池未接種的靶動物作對照(哨兵動物),以監視動物是否受到田間感染。

4．主動免疫的免疫期通常是指用受試疫苗進行一次接種后提供的保護作用的持續期。通常應在所推薦的加強接種開始的時間之前,對接種過的動物進行攻毒來確定。

5．如有充分的試驗依據證明適當指標(如抗體水平)與靶動物免疫攻毒保護率間存在良好的定性或定量關系,則可用替代指標來衡量疫苗接種后的免疫力。

6．通常情況下,不接受用非靶動物試驗獲得的免疫期試驗數據。

(四)血清學效力檢驗與靶動物免疫攻毒保護相關性的研究

當成品的效力檢驗中采用血清學方法測定免疫動物抗體反應,而不采用免疫攻毒試驗時,應事先進行平行關系驗證試驗,以證明選用該血清學方法的科學性。具體試驗方法是:用不同劑量的受試疫苗免疫接種動物,以便獲得具有不同抗體水平的動物,根據抗體水平的高低,將動物分為若干組,用已經選定的強毒株按照預定劑量進行攻毒。對抗體水平與攻毒保護率之間的關系進行分析。

(五) 不同血清型或亞型間的交叉保護力試驗

有些傳染病病原存在多個血清型或血清亞型,應進行交叉保護力試驗。其方法為:用推薦使用劑量疫苗接種一定數量的動物,在產生免疫力后,分別用不同血清型或血清亞型的強毒株進行攻毒,觀察其交叉保護力。通過本試驗篩選疫苗菌(毒、蟲)株,并為合理使用疫苗提供依據。

(六) 替代動物的效力檢驗與靶動物效力檢驗結果相關性的研究

一些制品的效力檢驗用靶動物來源困難、費用高,可使用替代動物,但應進行靶動物與替代動物免疫攻毒保護力平行關系的試驗研究,證明具有平行關系者,方可用替代動物代替靶動物。

(七) 不同接種途徑對靶動物的效力試驗

水生動物疫苗的接種途徑主要包括注射、口服和浸泡等。根據制品的種類、特點,以及相關試驗數據,選用合適的接種途徑作為推薦接種途徑。

(八) 接種后動物體內抗體消長規律的研究

免疫動物后,定期采血測定免疫動物產生抗體的最早時間、抗體高峰期、抗體持續期,為制定免疫程序提供依據。

(九) 相關說明

上述實驗室效力試驗項目中,第(一)、(二)、(三)通常是必不可少的,第(四)、(五)、(六)、(七)、(八)項有時不是必須的,應根據制品的種類、性質、靶動物、質量標準等具體情況選擇進行。第(一)項通常是成品效力檢驗標準的最直接依據,應有連續 3 批實驗室制品的試驗數據。

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